La multiplication végétative in vitro du Saintpaulia est un exemple remarquable du phénomène de différenciation cellulaire caractéristique du monde végétal.

Partant d’un fragment de feuille saine, on peut obtenir des milliers de plantes identiques à la plante mère et ceci dans un temps très court et indépendamment des saisons.

Obtenir une telle multiplication de plantes à partir d’un fragment de feuille serait impossible avec les techniques classiques de multiplication des végétaux (bouturage en terre…) : la contamination par les bactéries du sol, les champignons et la nécrose détruirait le fragment.

En revanche, dans des conditions aseptiques, on maîtrise complètement la multiplication de la plante puisque l’on connaît et on besoin on peut faire varier les conditions physiques (lumière, température …), la composition chimique du milieu et l’action des phytohormones.

C’est l’exemple d’une biotechnologie.

PRINCIPE GENERAL

Une feuille de Saintpaulia est désinfectée, rincée à l’eau déminéralisée stérile, découpée avec un scalpel (ou des ciseaux) et déposée sur la milieu de culture SP1.

Après environ 4 à 6 semaines, sous l’effet des phytohormones, on voit apparaître un grand nombre de micro feuilles de quelques millimètres. A ce stade, on peut diviser cette touffe en plusieurs petits plants et les remultiplier en les repiquant sur le milieu SP1 (micropropagation). Cette opération peut être répéter plusieurs fois.

Après la phase de multiplication, on peut diviser la touffe et repiquer les petites plantules sur le milieu d’enracinement SP2.

6 à 8 semaines plus tard, les plantules enracinées peuvent être transférées en serre pour la phase d’acclimatation.

PREPARATION DU MATERIEL ET DES MILIEUX

1. Matériel et produits nécessaires :

-        une marmite à pression ou un autoclave
-        éprouvettes pour mesurer l’eau
-        Erlenmeyer ou ballon … pour faire fondre le milieu de culture
-        six bocaux pour la désinfection des pousses
-        flacons pour répartir les milieux
-        un bec Bunsen ou une lampe à alcool
-        pinces
-        scalpels ou ciseaux
-        soucoupes stériles ou boîtes de Petri stériles
-        eau distillée ou déminéralisée
-        eau de Javel (de type Javel Plus)
-        alcool à brûler

2. Préparation du milieu :

 Verser la poudre dans un récipient et ajouter la quantité d’eau distillée correspondant au volume de la dose.

Faire fondre le milieu dans un bain-marie bouillant ou au four à micro-ondes. Quand le milieu est totalement fondu, il est limpide. Il est très important que le milieu soit entièrement fondu avant de le stériliser.

Répartir le milieu dans les flacons qui serviront pour la culture.

Fermer les flacons.

Si vous stérilisez à l’aide d’une marmite à pression, placer environ 2 litres d’eau au fond de la marmite et poser les flacons dans le panier. Stériliser 30 mn à partir du sifflement de la soupape en maintenant la pression au maximum ou à l’autoclave (25 mn à 115°C ou 20 mn à 120°C).

A la fin du temps de stérilisation, laisser refroidir sans enlever la soupape (ce qui ferait sauter les bouchons).

Sortir les flacons encore chauds et les poser en position inclinée afin qu’ils puissent refroidir et se solidifier (prévoir environ 3 heures).

Prévoir également de stériliser l’eau distillée servant à la désinfection de la plante (4 bocaux par groupe). Le temps de stérilisation peut dans ce cas être un peu plus long.

Avec l’eau, vous pouvez également stériliser les instruments (pinces, scalpels, ciseaux …) après les avoir enveloppés dans du papier aluminium.

MISE EN CULTURE

1. Matériel et produits nécessaires par groupe :

Matériel :

-        2 bocaux pour la désinfection
-        1 verre pour placer les instruments dans l’alcool
-        1 scalpel ou 1 paire de ciseaux
-        1 pince
-        1 boîte de Petri stérile ou 1 soucoupe stérile
-        1 bec Bunsen ou 1 lampe à alcool

Solutions :

-        liquide vaisselle
-        alcool à brûler
-        eau de Javel de type « Javel plus » diluée selon les conseils du fabricant
-        4 bocaux d’eau distillée stérile

Plante :

-        un plant de Saintpaulia.

2. Préparation du plan de travail : 

Avant de manipuler, se laver soigneusement les mains et les avant-bras au savon.
Nettoyer le plan de travail avec de l’eau de Javel.
Placer au centre le bec Bunsen ou la lampe à alcool.
Placer sur la droite (pour un droitier) un verre contenant de l’alcool dans lequel seront placés les instruments.
Devant le bec Bunsen, placer une boîte de Petri ou une soucoupe stérile dans laquelle sera découpée la plante.
Sur la gauche du bec Bunsen, placer le flacon contenant le milieu de culture.
Derrière le bec Bunsen, placer les bocaux servant à la désinfection.

3. Désinfection de la plante : 

Prélever une feuille mature, c’est à dire située à la périphérie de la plante.
La rincer à l’eau du robinet.
La placer 5 minutes dans un mouillant composé d’une goutte de liquide vaisselle dans de l’eau.
Désinfecter ensuite par passage de 12 minutes dans l’eau de Javel de type « Javel plus ».
La feuille étant désinfectée, les étapes suivantes doivent être réalisées en milieu stérile avec du matériel stérile. Pour stériliser les instruments, les placer dans l’alcool puis les flamber rapidement afin d’éliminer l’alcool. Répéter cette opération 2 à 3 fois avant chaque utilisation. 
Rincer la feuille par 4 bains de 5 minutes chacun dans l’eau distillée stérile. 

 Attention :  pendant la manipulation, ne jamais toucher l’extrémité des instruments ou la plante avec les mains, ne pas parler, ne pas faire de courants d’air, bien fermer portes et fenêtres.

4. Mise en culture :

Dans la boîte de Petri ou la soucoupe stérile, couper selon la taille de la feuille entre 1 et 6 carrés d’environ 1 cm de côté, de préférence à la base de la feuille. Ces carrés sont appelés explants.
Ouvrir un flacon SP1 à côté du bec Bunsen.
Placer un explant dans le flacon, face inférieure de la feuille en contact avec le milieu de culture.
Flamber l’encolure du flacon et le reboucher.
Placer les flacons en position horizontale à la lumière du jour en évitant l’ensoleillement direct (qui risquerait de brûler la plante). L’hiver, en période de jours courts, vous pouvez éclairer les flacons matin et soir avec des lampes de type lumière du jour.

MULTIPLICATION DES VITROPLANTS (étape facultative)

Au bout de 4 à 6 semaines, on voit de nombreuses touffes de Saintpaulia à la surface de l’explant.
Ces touffes peuvent être divisées et chaque plantule isolée peut être repiquée sur le milieu SP1 pour obtenir une nouvelle multiplication.
Pour effectuer cette étape, poser la touffe sur une soucoupe ou une boîte de Petri stérile sur le plan de travail servant pour la manipulation et à l’aide d’un scalpel stérile, la diviser.
Repiquer les plantules obtenues sur un milieu SP1.

PASSAGE SUR MILIEU D’ENRACINEMENT

Quand les plants se sont suffisamment multipliés, repiquer chaque plantule obtenue sur le milieu SP2 en position horizontale .

1. Matériel nécessaire :

- bec Bunsen ou lampe à alcool
- scalpel
- pince
- boîte de Petri ou soucoupe stérile

2. Préparation du milieu SP2 :

Procéder comme pour le milieu SP1

3. Manipulation :

Placer le flacon de milieu SP1 près de la flamme du bec Bunsen ou de la lampe à alcool près du plan de travail préparé comme indiqué auparavant.
Flamber l’encolure du flacon de milieu SP1 et sortir délicatement la touffe avec la pince stérile et la poser dans la boîte de Petri stérile.
Isoler des plantules à l’aide du scalpel et les repiquer sur le milieu d’enracinement SP2.
Flamber l’encolure du flacon et refermer.

4. Evolution :

Les plantules se développent et les racines se forment.
Quand les racines se sont développées, au bout d’environ 6 semaines, elles peuvent être transférées en pots sous serre.

TRANSFERT EN SERRE :

Stériliser du terreau pour repiquage de jeunes plants en procédant comme pour l’eau distillée.
Placer ce terreau dans des petits pots.
Prélever les plantules à partir des flacons de milieu SP2 en faisant attention à ne pas casser les racines.
Eliminer la gélose qui adhère aux racines en les trempant dans de l’eau.
Repiquer les plantules enracinées dans les petits pots.
Bien arroser.
Placer les pots dans une mini-serre.
Au bout d’environ 15 jours, on peut commencer à entrouvrir progressivement la mini-serre afin d’acclimater la plante à une atmosphère plus sèche. Lorsque le plant de Saintpaulia paraît  suffisamment vigoureux, on peut le sortir de la serre.
Pendant cette phase d’acclimatation, on peut également appliquer des fongicides et insecticides.

PLANNING DE LA MANIPULATION 

JOUR J-1

Préparation des milieux et du matériel

JOUR J

Mise en culture sur le milieu SP1

JOUR J + 6 semaines

Repiquage sur le milieu SP2 ou

Multiplication sur le milieu SP1

JOUR J + 12 semaines

Transfert en serre

Préparation de la plante